2020-06-12
在已知的6 000多種遺傳病中, 目前只有大約5%的疾病可以通過小分子藥物或酶替代療法進行治療，超過95%的遺傳疾病無有效的治療方案, 治愈更是無從談起。基因治療為遺傳疾病帶來了希望，尤其對于單基因罕見病，基因治療提供了一種從根本上治愈遺傳疾病的可能，即僅需一次治療就可以達到終身治愈的目的。近幾年來基因編輯技術的快速發展，迎來了一個全新的時代，以CRISPR/Cas9、單堿基編輯、CART等技術引領的產業變革越來越烈，讓我們看到這些新興技術的巨大潛力，并激發了無限的機遇。
邦耀生物自2013年成立以來，一直聚焦于基因編輯和基因治療領域，經過幾年發展，基于基因編輯和基因治療的技術正在不斷取得各種突破并逐步走向成熟。特別是近1年來，邦耀已在國際著名學術期刊Nature Biotechnology、Nature Medicine、Nature Cell Biology、Cell Research等發表多篇學術論文，特別是在單堿基編輯工具開發領域的相繼突破，為基礎研究和遺傳性疾病如β-地中海貧血的治療提供了新的發展方向和工具。
目前邦耀已自主研發并成功搭建起基因治療技術轉化平臺，并且在基因編輯和基因治療領域已經遞交30余項全球及中國專利申請。其中，基因治療β-地中海貧血的產品管線，邦耀生物采用了具有自主知識產權的基因編輯技術重新開啟胎兒期的γ珠蛋白的表達，代替有缺陷的β珠蛋白的治療方案，可以有效緩解地貧癥狀，是一種更為高效、便捷、安全且成本極低的治療手段，具有很大的臨床轉化潛力。該項目正與國內多家頂級醫療單位攜手，希望借此項研究及其臨床實驗的推廣，使得基于基因編輯的基因治療成為我國β-地中海貧血患者全新的臨床治療方案，并有望實現“一次治療終身治愈”的療效。
值得一提的是，除了重點布局在地中海貧血的產品管線，邦耀也正在積極拓展其他遺傳疾病領域。2020年5月，邦耀生物科學家劉明耀教授及李大力教授團隊，先后在基因治療和腎臟疾病頂級雜志Molecular Therapy和Kidney International發文，表明基因治療在I型酪氨酸血癥、I型原發性高草酸尿癥等遺傳疾病中的巨大潛力。
2020年5月7日，基因治療頂級雜志Molecular Therapy在線發表了題為“Amelioration of an Inherited Metabolic Liver Disease through Creation of a De Novo Start Codon by Cytidine Base Editing”的研究論文。該研究利用重組腺相關病毒（rAAV）遞送拆分型胞嘧啶單堿基編輯工具BE4max，成功治愈了Ⅰ型酪氨酸血癥（HTⅠ）小鼠。該研究首次開創性地利用單堿基編輯技術在小鼠基因組上引入功能性元件來治療遺傳疾病，通過單堿基編輯在起始密碼子突變的延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fah）基因的5’UTR引入一個全新的起始密碼子，重新開啟該基因的表達，成功治愈了因缺失該酶而出現嚴重肝損傷的HTⅠ小鼠。華東師范大學楊磊，王立人和霍雅楠為本文共同第一作者。
I型酪氨酸血癥
Ⅰ型酪氨酸血癥（HTⅠ）是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，由于缺失酪氨酸代謝途徑中最后一步反應所需的延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH），使得酪氨酸代謝受阻，導致延胡索酰乙酰乙酸（Fumarylacetoacetate，FAA）、馬來酰乙酰乙酸（Maleylacetoacetate，MAA）和琥珀酰丙酮（Succinylacetone，SA）等有毒代謝產物的積累，造成嚴重的肝腎損傷。目前HTⅠ的發病率為1/12000到1/100000之間, 若不給予任何治療，患兒通常在一歲內就會死亡。
現有療法的缺陷：
目前，服用羥基苯丙酮酸雙加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase）的抑制劑尼替西農（NTBC）是臨床上最有效的治療方法。雖然NTBC為HTⅠ 病人提供了有效的治療，但有研究表明TNBC會影響兒童的智商，學習和社會認知能力。
本技術方案優勢：
ClinVar 數據顯示，人類約58%的遺傳疾病是由點突變引起的，需要通過堿基轉換來進行修復，而HTⅠ幾乎全是由點突變導致，單堿基編輯技術的出現為治療HTⅠ和其他由點突變引起的遺傳疾病提供了一個全新的策略。HTⅠ是一個理想的基因治療模型，被修復的肝細胞具有強大的生長優勢，因此，只需要修復一小部分肝細胞，在不給予NBCT治療的情況下，這些肝細胞就會不斷擴增，最終形成一個全新的健康的肝臟。
圖1：治療策略示意圖
在體外實驗中，研究人員利用胞嘧啶單堿基編輯工具BE4max靶向HTⅠ小鼠（FahNS/NS）Fah基因突變的起始密碼子（G1TG3），但由于G1和G3都位于BE4max的編輯窗口內，導致G1和G3同時被編輯，不能有效形成正常的起始密碼子（A1TG3）。為了解決這一問題，研究者另辟蹊徑，利用BE4max靶向Fah基因的5’UTR區域，試圖將距突變的起始密碼子上游12bp處的G-12TG-10轉變為一個全新的起始密碼子（A-12TG-10），在該位點中，G-12位于BE4max的編輯窗口內，但G-10在編輯窗口外，經編輯可以高效地形成起始密碼子(圖1)。采用這種策略，研究人員利用rAAV遞送拆分型BE4max到FahNS/NS小鼠肝臟，在不撤去NTBC藥水的情況下，編輯效率可高達14%，撤藥治療兩個月后編輯效率可高達40%，同時肝損傷得到顯著緩解（圖2）。
圖2：血清肝功能指標檢測
通過檢測預測的10個脫靶位點，沒有發現脫靶編輯。該研究表明單堿基編輯工具可以通過rAAV遞送到肝臟并進行高效編輯，同時，通過單獨引入一個起始密碼子可以用于治療由起始密碼子突變而導致的遺傳疾病。
二、基因療法可以有效緩解Ⅰ型原發性高草酸尿癥
2020年5月25日，華東師范大學李大力教授團隊和上海交通大學醫學院附屬新華醫院耿紅全團隊合作在Kidney International發文，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對Ⅰ型原發性高草酸尿癥（PH1）大鼠進行代謝通路重編程，通過阻止上游Hao1基因的表達有效降低尿草酸水平，長期有效地緩解疾病表征。值得一提的是，該研究報道的動物模型是一種新的PH1大鼠模型, 在部分人源化的AGXT基因中攜帶D205N突變，出生后不久即表現出明顯的高草酸和結晶尿等疾病表征，相比原有的小鼠與人類PH1疾病表現更加接近。上海交通大學醫學院附屬新華醫院鄭銳，李約延和華東師范大學王立人為本文共同第一作者。
Ⅰ型原發性高草酸尿癥（PH1）
I型原發性高草酸尿癥是常染色體隱性遺傳疾病，由于患者體內編碼丙氨酸/乙醛酸轉氨酶（AGT）的AGXT基因突變所致的肝細胞內代謝異常。正常AGXT基因編碼的AGT蛋白負責將乙醛酸催化成甘氨酸，AGXT的突變導致患者肝細胞內的乙醛酸無法被正常代謝，致使大量堆積的乙醛酸被氧化成草酸進入血液循環。高濃度的草酸導致腎臟和尿路結石，造成泌尿系統梗阻、腎臟損傷和終末期腎?。‥SRD），超過50%的PH1患者在30歲以前進展為終末期腎病。
現有療法的缺陷：
該病目前無特效藥，保守治療效果極差，雖然肝腎聯合移植可以根治PH1，但器官供體缺乏、終身服用抗排異藥物、手術創傷極大等因素使得絕大多數PH1患者無法得到根治性治療。先后有研究團隊在PH1小鼠模型（Agxt-/-）中注射載有AGXT基因的腺相關病毒（AAV）或腺病毒（Adv）進行基因治療，草酸水平在短期內顯著下降，但隨著患者肝臟細胞的分裂、更新，最初遞送的外源AGXT基因會逐漸丟失，治療效果也會隨之下降。需要短時間內重復治療。另有研究顯示通過SiRNA沉默乙醛酸的上游反應酶體乙醇酸氧化酶（由HAO1基因編碼）可以有效切斷PH1小鼠體內的乙醛酸來源進而降低小鼠體內草酸水平，但該療法同樣需要重復給藥。
本技術方案優勢：
相比siRNA技術和基因替代療法，CRISPR/Cas9技術能夠更高效持久地敲除體內的HAO1基因，免去了患者長期反復用藥的負擔。首先通過CRISPR/Cas9系統產生一個新的PH1大鼠模型，該模型在部分人源化的Agxt基因中攜帶D205N突變。AgxtD205N突變大鼠AGT蛋白表達缺失，在乙二醇負荷后1個月內出現高草酸尿，腎臟草酸鈣(CaOx)沉積嚴重，提示新模型相比原有的小鼠模型與人類疾病的相關性更強。
為了驗證該模型是否可用于創新療法的開發，研究人員通過AAV載體將靶向乙醇酸氧化酶的CRISPR/Cas9系統遞送到新生PH1大鼠體內。結果顯示該策略在肝臟的HAO1基因中產生了30%的編輯效率，在12個月的研究周期內，治療組的尿草酸水平比對照組降低了42%，并防止了PH1大鼠形成嚴重的腎草酸鈣沉積。以上結果表明，這種部分人源化的AgxtD205N大鼠不僅是了解PH1病理機制的合適模型，而且能用于更多創新療法的開發（例如文中所展示的通過基因編輯重新編程代謝途徑）。
基因治療一直被認為是最有可能從根本上治愈遺傳疾病的解決方案，根據2019年發布的報告，預計在未來六年內，將有大約60種基因療法產品獲批，這些藥物的銷售額在2024年將達到146億美元，約占全球醫藥總收入的1.2%，可見未來基因治療罕見病的廣泛應用前景。
邦耀生物自成立以來，一直放眼全球，全面布局基因治療領域，除了重點布局基因治療β-地中海貧血癥之外，同時也重點關注酪氨酸血癥、血友病等多種罕見遺傳病，未來邦耀將持續通過掌握核心技術以及生產能力來保證在這一賽道的競爭力，如不斷優化新型基因治療技術(編輯工具、治療基因的改造)，及新型基因遞送載體的組合治療，早日為遺傳疾病患者帶來福音。
附原文鏈接：
1. Yang L, Wang L, Huo Y, et al. Amelioration of an Inherited Metabolic Liver Disease through Creation of a De Novo Start Codon by Cytidine Base Editing [published online ahead of print, 2020 May 7]. Mol Ther. 2020;S1525-0016(20)30235-5. doi:10.1016/j.ymthe.2020.05.001
2. Zheng R, Li Y, Wang L, et al. CRISPR/Cas9-mediated metabolic pathway reprogramming in a novel humanized rat model ameliorates primary hyperoxaluria type 1 [published online ahead of print, 2020 May 25]. Kidney Int. 2020;S0085-2538(20)30554-8. doi:10.1016/j.kint.2020.04.049
